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磁珠法核酸提取裂解液的作用原理

磁珠法核酸提取裂解液的作用原理

1、盐酸胍、尿素

  盐酸胍在浓度为 4-8mol 时可断裂氢键,有两种可能机制:1、变性蛋白和盐酸胍、尿素优先结合,形成变性蛋白-变性剂复合物,当复合物被除去,引起 N-D反应平衡向右移动,随着变性剂浓度增加,天然状态的蛋白不断转变为复合物,最终导致蛋白质完全变性;2、盐酸胍、尿素对氨基酸具有增溶作用,能形成氢键,当浓度高时,能破坏水的氢键结构,成为非极性残基的较好溶剂,使蛋白质内部的疏水残基伸展和溶解性加强,盐酸胍、尿素引起的蛋白变性往往是不可逆的。 同时盐酸胍是一个核酸酶的强抑制剂,但并不是一种足够强的变性剂,可以允许完整的 RNA 从富含 RNase 的组织中提取出来。高浓度尿素同样可以使蛋白质变性并抑制 Rnase 活性。

  2、异胍

  蛋白质变性剂,能迅速溶解蛋白质,导致细胞结构破碎,核蛋白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核酸分离。在通常使用的蛋白质变性剂中作用最强的是异硫氰酸胍,它们可以使多数蛋白质转换成一种随机的卷曲状态。含有强力的阴离子和阳离子基团,它们可以形成较强的氢键。在存在的情况下,异硫氰酸胍可以断裂氢键,而去垢剂,如 SDS 存在的情况下,可以破坏疏水作用。

  3、二硫苏糖醇(DTT)

  二硫苏糖醇的主要作用是破坏 RNase 蛋白质中的二硫键,使 Rna 酶变性,同时抑制酚类氧化引起的磷酸二酯键的断裂及导致 RNA 和 DNA 的交联。 二硫苏糖醇刺激性气味不大,毒性较低。由于容易被空气氧化,因此 DTT的稳定性较差;但冷冻保存或在惰性气体中处理能够延长它的使用寿命。由于质子化的硫的亲核性较低,随着 pH 值的降低,DTT 的有效还原性也随之降低;DTT或含有 DTT 的溶液不能进行高压处理。

  4、蛋白酶 K

  一种切割活性较广的蛋白酶。它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键。此酶经纯化去除了 RNA 酶和 DNA 酶活性。由于蛋白酶 K 在尿素和 SDS中稳定,还具有降解天然蛋白质的能力,因而它应用很广泛,包括制备脉冲电泳的染色体 DNA,蛋白质印迹以及去除 DNA 和 RNA 制备中的核酸酶。蛋白酶 K 的一般工作浓度是 50—100μ g/ml。在较广的 pH 范围内(pH 4-12.5)均有活性。 以上是裂解液中常用的试剂,在实际操作中针对不同的样本(植物组织、动物组织、全血、血清、质粒)应配制不同浓度的裂解缓冲液,并根据样本的状态(质量、体积)及期望达到的实验结果(核酸的浓度、OD 比值)对裂解液的浓度进行调整,此外,还要对结合、洗涤、洗脱三个步骤进行优化,从而得到较完美的核酸提取方案。
 

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